Pada artikel sebelumnya Saya sudah menjelaskan tentang Konsep Dasar Ketidakpastian pengukuran dan Prinsip dari Perhitungan Ketidakpastian Pengujian di Laboratorium. Selanjutnya dalam kesempatan ini, Saya akan memberikan salah satu contoh perhitungan ketidakpastian metode HPLC Okratoksin A (selanjutnya bisa disingkat dengan OTA) dengan metode HPLC merujuk pada AOAC Official Method of Analysis, 991.44, 2005.

Sebenarnya perhitungan konsep estimasi ketidakpastian untuk metode dengan alat instrumen yang beragam itu adalah kurang lebih sama. Hanya ada bagian kecil yang berbeda tergantung dari cara pengerjaannya secara lebih detail. Untuk itu langsung saja Saya uraikan perhitungannya berikut ini.

1. Menentukan Spesifikasi Kuantitas Pengukuran

Perhitungan ketidakpastian metode HPLC menggunakan fishbone mendasarkan pada formula atau rumus perhitungan dan komponen-komponen lain yang tidak ada dalam rumus, namun juga mempunyai pengaruh terhadap ketidakpastian. Berikut rumus perhitungan dari penetapan Okratoksin A.

Konsentrasi OTA (ng/g) =

2. Identifikasi Sumber Ketidakpastian

Penentuan Diagram Fishbone

3. Kuantifikasi Sumber Ketidakpastian dan Perhitungan Ketidakpastian Gabungan

Setelah mengidentifikasi sumber ketidakpastian, langkah selanjutnya adalah mengukur ketidakpastian yang muncul dari sumber tersebut dengan mengevaluasi ketidakpastian yang timbul dari masing-masing sumber dan menggabungkannya. 

a. Ketidakpastian bobot contoh (µM_contoh)

Ketidakpastian kalibrasi timbangan N-3 (certified) : 0,26 mg

µ kalibrasi = (µ sertifikat kalibrasi/2) = 0,26 mg/2 = 0,13mg

data logbook / presisi sertifikat kalibrasi timbangan, SD : 0,03 mg (µ presisi)

ketidakpastian M contoh (µM_contoh)  =

                                                          =  

b. Ketidakpastian faktor pengenceran (µFp)

Fishbone

dari data logbook  ketidakpastian pipet volumetrik 5 mL  = 0,01 mL

                                                                                 10 mL = 0,01 mL

                                                                                 50 mL = 0,05 mL

• µ 50 mL = Qu/K = 0,05 / 2 = 2,5×10^-2 
• µ 10 mL = Qu/K = 0,01 / 2 = 5×10^-3 
• dan µ 5  mL  = Qu/K = 0,01 / 2 = 5×10^-3 

 µFp  = Fp X

         = 10 X

         = 0,0122

c. Ketidakpastian volume pelarutan (µ Vt)

Dari logbook nilai data ketidakpastian mikropipet adalah 3,4 µL

Ketidakpastian volume pelarutan (µVt) = Qu/k = 3,4 µL/2  = 1,7 µL

d. Ketidakpastian recovery (µ recovery)

Tabel data recovery

Sample(contoh+spike)	% recovery
1	88,42
2	96,37
3	97,48
4	91,64
5	98,49
6	94,85

SD = 3,84

ketidakpastian  recovery (µrecovery) = SD X % = 3,84 X 100^-1 = 0,084

e. Ketidakpastian presisi metode (µ PM)

sample	konsentrasi (ng/g)
1	1,75
2	1,61
3	1,47
4	2,01
5	1,94
6	1,58
7	1,79
rata-rata	1,74
SD	0,20

% RSD =

µ PM = 11,49 X 100^-1 = 0,1149

f. Ketidakpastian Rs (µRs)

Tabel perhitungan ketidakpastian Rs

Sample	luas area
1	2,64549
2	2,25335
3	2,07753
4	3,03020
5	2,68306
6	2,22501
7	2,49981
SD	0,3291
RSD	13,16

Dari logbook kalibrasi alat, ketidakpastian KCKT 1% RSD

µRs = 0,01 X RSD = 0,01 X 13,16 = 0,1316

g. Ketidakpastian Ra (µRa)

Rumus

Fishbone

Ketidakpastian Rn/Cn (respon area/kons. Standar)

rumus

Rn/Cn =

Fishbone

ketidakpastian C std _n

Rumus

Cstd _n =

Fishbone

ketidakpastian C induk (µ C ind.)

penimbangan standar = 4,6 mg

Rumus

C induk (mg/mL) = bobot std OTA (mg) / 250 mL

Fishbone

 

Ketidakpastian bobot contoh (µM_contoh)

ketidakpastian kalibrasi timbangan N-3 (certified) : 0,26 mg

µ kalibrasi = (µ sertifikat kalibrasi/2) = 0,26 mg/2 = 0,13mg

data logbook / presisi sertifikat kalibrasi timbangan, SD : 0,03 mg (µ presisi)

µM_contoh = = = 0,1367 mg

ketidakpastian kemurnian (µ kemurnian)

Dari sertifikat kemurnian standar OTA = 99±1%

µ kemurnian = =5,77 x 10^-3

                      

ketidakpastian labu takar 250 mL (µLT250mL)

Ketidakpastian dari data log book = 0,045 mL

µ LT 250mL = 0,045/2 = 0,0225 mL

Tabel Ketidakpastian

kuantitas	X	sat	µX	sat	(µX/X)2
penimbangan	4,6	mg	0,1367	mg	0,000883
LT 250 mL	250	mL	0,0225	mL	8,1E-09
kemurnian	0,99	–	0,00577	–	3,4E-05
jumlah ()	0,000917

Ketidakpastian C ind.

Konsentrasi Std induk = 18,4 µg/mL

µ C ind. =

µ C std _n = C std _n

Ketidakpastian mikropipet 5-50 µL

Ketidakpastian dari data log book = 0,025 µL

µ mikropipet = 0,025 µL / 2 = 0,0125µL

Ketidakpastian mikropipet 100-1000 µL

Ketidakpastian dari data log book = 3,4 µL

µ mikropipet = 3,4 µL /2 = 1,7 µL

Tabel standar

standar (ng/µl)	luas area	R/C	Ra
0,092	9,31589	5,06298	6,90233
0,23	30,98813	6,73655
0,46	75,00861	8,15311
0,92	131,80789	7,16347
1,84	272,15675	7,39556

Ketidakpastian Rn/Cn (respon area/kons. Standar)

Ketidakpastian Ra

Tabel Ketidakpastian

sumber	X	satuan	µX	satuan	(µX/X)	(µX/X)2
M sampel	50000	mg	0,1367	mg	0,000002734	7,47E-12
Fp	10	–	0,0122	–	0,00122	1,48E-06
Vt	500	µL	1,963	µL	0,0039	1,54E-05
Recovery	0,9454	–	0,0384	–	0,0406	1,65E-3
Rs	3,0302	–	0,1316	–	0,04343	1,89E-3
Ra	6,9023	ng-1	0,5395	ng-1	0,07816	6,11E-3
Pres. metode	–	–	0,11		–	–
Jumlah	9,66E-3

µ C’’ (µC tanpa Presisi Metode)

Ketidakpastian Diperluas

U = K x µ C’

    = 2 x 0,23 ng/g    (95%)

    = 0,46 ng/g

Hasil pelaporan  

Y ± U  = (2,01 ± 0,46) ng/g (rentang kepercayaan 95%)