Pengukuran berdasarkan cahaya ataupun radiasi elektromagnetik seperti spektrofotometer UV-Vis sangat luas digunakan dalam dunia kimia analitik. Studi yang mempelajari tentang interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi disebut dengan spektroskopi. Dalam spektroskopi serapan (absorpsi), jumlah radiasi yang diserap oleh spesi, baik molekular maupun atomik, dapat menggambarkan konsentrasi dari sampel,

Baca juga: Metode Gravimetri dalam Analisis Kimia

Proses Penyerapan Cahaya dalam Spektrofotometer UV-Vis

Interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan materi akan menyebabkan terjadinya transisi antartingkat energi yang berbeda dari suatu spesi kimia. Ketika materi mengabsorpsi radiasi elektromagnetik yang mengandung foton, materi akan mengalami perubahan energi. Ion atau molekul tersebut akan tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi. Singkatnya, penyerapan foton oleh sampel akan mengakibatkan sampel tersebut memperoleh energi foton yaitu E= hc/λ, dimana h merupakan konstanta Planck yaitu 6,62×10^-34.

Setiap spesi kimia mempunyai kemampuan untuk mengabsorpsi frekuensi khasnya. Suatu materi hanya akan menyerap radiasi elektromagnetik atau cahaya jika energi cahaya tersebut sesuai dengan kebutuhan energi materi. Energi tersebut yang akan digunakan oleh materi untuk melakukan transisi.

Baca juga: Prospek Kerja Analisis Kimia di Tahun 2022

Komponen Dasar Instrumen Spektroskopi

Sebelum mengetahui lebih lanjut secara spesifik mengenai spektrofotometer UV-Vis, Anda wajib mengetahui komponen dasar apa saja dari instrumen spektroskopi.

1. Sumber energi

Semua jenis spektroskopi memerlukan sumber energi berupa foton. Untuk pengukuran di daerah UV-Vis, sumber energi yang paling umum adalah lampu katoda berongga atau hollow cathode lamp. Sumber energi ini biasa digunakan untuk spesi atomik sedangkan untuk spesi molekular adalah laser. Sumber energi lainnya yaitu lampu H₂ dan D₂, lampu tungsten, nernst glower, dan globar.

2. Pemilih panjang gelombang

Ini menjadi komponen penting terutama dalam spektrofotometer UV-Vis. Komponen ini berfungsi dalam membatasi cahaya yang terserap oleh sampel agar hanya menyerap pada panjang gelombang tertentu. Terdapat tiga jenis pemilih panjang gelombang yaitu filter absorpsi dan interferensi, monokromator, dan interferometer. Monokromator berfungsi untuk mengubah sumber cahaya polikromatik menjadi monokromatik.

3. Detektor

Detektor yang paling umum dan modern adalah transduser. Komponen ini berfungsi untuk mengubah sinyal yang mengandung foton agar menjadi suatu sinyal elektronik. Selanjutnya, sinyal ini akan memasuki suatu prosesor.

4. Prosesor sinyal

Sinyal elektronik dari transduser selanjutnya terkirim ke prosesor sinyal. Sinyal ini yang nantinya akan tertampil dalam penampil data, seperti dalam bentuk angka digital ataupun meteran analog. Hal ini yang akan mempermudah analis untuk membaca dan menginterpretasi data hasil pengukuran.

Baca juga: Kalibrasi Timbangan Digital yang Benar

Spektrofotometer UV-Vis: Prinsip dan Tipenya

Sesuai dengan namnaya, spektrofotometer UV-Vis berarti spektrofotometer yang menyerap cahaya pada daerah UV dan cahaya tampak, yaitu kurang lebih 190 hingga 900nm. Rentang panjang gelombang UV yaitu 100 hingga 400nm sedangkan cahaya tampak pada kisaran 400 hingga 800nm. Spektrofotometer UV-Vis merupakan instrumen analisis yang bersifat nondestruktif sehingga Anda dapat menggunakan kembali sampel tersebut untuk analisis lanjutan.

Spektrofotometer UV-Vis dan Hukum Lambert-Beer

Informasi dari hasil pengukuran menggunakan spektrofotometer UV-Vis adalah berupa grafik absorbansi ataupun transmitansi terhadap panjang gelombang. Berdasarkan Hukum Lambert-Beer, intensitas cahaya dari sumber akan secara kuantitatif berkaitan dengan jumlah cahaya yang terserap oleh sampel (absorbansi). Absorbansi ini juga sebanding dengan konsentrasi analit dan panjang medium atau dalam hal ini adalah lebar wadah sampel.

Perhitungan dengan Hukum Lambert-Beer sangat berguna untuk mengetahui konsentrasi suatu sampel. Tentunya, Anda harus melakukan serangkaian pengukuran dengan larutan standar. Persamaan Hukum Lambert-Beer adalah sebagai berikut.

A merupakan absorbansi yang terbaca pada alat, atau bentuk logaritmik negatif dari transmitansi. a menandakan suatu konstanta kesebandingan yaitu absorptivitas molar. b merupakan panjang medium dan c merupakan konsentrasi.

Tipe spektrofotometer UV-Vis

Komponen penyusun spektrofotometer UV-Vis utamanya tidak jauh berbeda dari instrumen spektroskopi lainnya. Namun umumnya, spektrofotometer terbagi menjadi dua macam yaitu berkas tunggal (single beam) dan berkas ganda (double beam).

a. Spektrofotometer UV-Vis berkas tunggal

Pada spektrofotometer ini, semua cahaya yang berasal dari sumber melewati sampel. Oleh karenanya, pengukurannya berdasarkan intensitas masuk dan keluar sampel. Desain instrumentasi spektrofotometer berkas tunggal terbilang sederhana dibanding dengan tipe berkas ganda. Tipe ini terdiri dari monokromator dengan panjang gelombang tetap.

b. Spektrofotometer UV-Vis berkas ganda

Bedanya dengan tipe berkas tunggal, pada tipe ini cahaya dari sumber akan terbagi menjadi dua bagian yaitu berkas referensi (tidak memasuki sampel) dan berkas sampel (melewati sampel). Absorbansi yang terukur nantinya merupakan rasio antara berkas sampel dan referensi. Tingkat kebolehulangan pengukuran dengan spektrofotometer tipe ini sangat tinggi jika dibanding dengan tipe berkas tunggal.

Analisis sampel: blanko, pemilihan kuvet, dan panjang gelombang

Untuk keseluruhan analisis, pengukuran larutan blanko (larutan tanpa analit) perlu dilakukan sebelum pengukuran sampel berlangsung. Larutan blanko yang paling umum adalah air. Namun, hal ini bergantung pada larutan sampel Anda.

Ketika sedang menganalisis suatu kultur bakteri, maka blanko nya adalah media kultur yang steril. Selanjutnya, sinyal blanko secara otomatis akan membantu instrumen dalam memperoleh data absorbansi analit yang sesungguhnya.

Wadah atau medium tempat menampung sampel adalah kuvet. Anda wajib memperhatikan materialnya, yaitu harus transparan. Kuvet plastik umumnya jarang digunakan karena dapat menyerap UV. Sebagai gantinya, Anda dapat menggunakan kuvet berbahan kuarsa atau silika jika panjang gelombang kurang dari 300nm.

Panjang gelombang yang terpilih untuk pengukuran merupakan panjang gelombang yang mengindikasikan absorbansi maksimum dari sampel. Hal ini karena pada saat absorbansi maksimum, sensitivitas analisis sangat tinggi pada kondisi tersebut. Sehingga, Anda dapat memperoleh respon maksimum dalam analisis sampel.

Baca juga: Perhitungan Ketidakpastian Pengujian di Laboratorium

Aplikasi Spektrofotometer UV-Vis

Beberapa aplikasi umum dari spektrofotomer UV-Vis adalah sebagai berikut.

Analisis DNA dan RNA

Aplikasi dalam menentukan kemurnian dan konsentrasi dari DNA dan RNA dengan spektrofotometer UV-Vis telah umum dilakukan. Panjang gelombang analisis 230nm mengindikasikan adanya protein sedangkan 260nm menandakan adanya DNA dan RNA. Rasio absorbansi 260nm/230nm sangat penting untuk mengetahui kemurnian sampel DNA dan RNA dan dapat mengungkap kontaminasi protein atau senyawa kimia lainnya. Protein dapat menyerap cahaya pada 230nm sehingga akan menurunkan rasio 260/230 atau dengan kata lain terdapat kontaminasi protein terhadap sampel DNA dan RNA.

Kultur bakteri

Panjang gelombang 600nm diterapkan dalam pengukuran untuk mengestimasi konsentrasi sel dan pertumbuhannya.

Lain-lain

Dalam pengolahan air limbah, untuk memastikan suatu pewarna ataupun produk samping pewarna telah benar-benar hilang, Anda dapat membandingkan spektrum absorbansinya dari waktu ke waktu. Pengukuran absorbansi dari hemoglobin juga penting untuk menentukan konsentrasinya yang berperan penting dalam penelitian kanker. Pengukuran indeks warna pada oli trafo dengan spektrofotometer berperan dalam pemastian daya listrik tersalurkan dengan aman.

---

Penulis: Irne Dyah Ayu; Editor: Prima Nursyami